Welling. Images of nature. 

MATERIAL Y   MÉTODOS

Material y Reactivos

Todos los solventes, productos químicos y reactivos químicos utilizados son de alto grado de pureza, procedentes de Aldrich (Aldrich Chemical Co, Inc. - Wisconsin, U.S.A.), Applied Biosystems (Applied Biosystems - Perkin Elmer Division, U.S.A.), Bio-Rad (Bio Rad Laboratories - California, U.S.A.), Merck (Merck - Darmstadt, Germany), Sigma (Sigma Chemical Co - St. Louis, U.S.A.), Pierce (Pierce Chemical Company - Illinois, U.S.A). Las muestrasde la PLA₂ nativa purificada y modificada químicamente, son cedidas por el Laboratorio de Química de Proteínas del Instituto de Biología de la Universidade Estadual de Campinas – SP BRASIL.

La infraestructura, y equipos utilizados en la presente investigación, son compartidos, entre el Instituto de Biología de la Universidad del Estado de Campinas-SP BRASIL y el Laboratorio de Química Biológica del Departamento de Biología de la Universidad Nacional de San Agustín, Arequipa –

PERU.

Electroforesis en PAGE-SDS

La electroforesis en gel de poliacrilamida fue realizada siguiendo la metodología descrita por Laemmli (1970), en que las placas de poliacrilamida (PAGE) son preparadas de modo discontínuo, presentando un gel de concentración de 5 % y un gel de corrida de 12,5 %. Las placas fueron preparadas utilizando una solución de acrilamida stok (30%T, 0,8%C). El gel de concentración a 5 % fue preparado usando un tampón TrisHCl 0.5M de pH = 6,8 y el gel de corrida fue preparado usando tampón Tris-HCl 1M  de pH = 8,8.

A ambos geles se les agregó SDS al 20% en cantidad suficiente para llevar a una concentración final de 0.5% ( v/v ).

 La corrida electroforética es realizada en un sistema doble de miniplacas SE 250 Mighty Small II (Hoeffer scientific instruments). Tanto las muestras y los marcadores de masa molecular fueron disueltos en tampón de muestra (Tris-HCl 0,075M; pH = 6,8; 10% glicerol; 4% de SDS; 0,001% de Bromofenol). La corrida electroforética fue realizada a 30 mA. Los geles fueron coloreados con solución de Comassie Blue 0,05% a 37oC, y el exceso de colorante fue removido con ácido acético al 7 %.

Determinación de los  niveles de CK plasmáticos en  ratones inoculados por vía intramuscular (miotoxicidad local) y intravenosa (miotoxicidad sistémica).

Se utiliza una solución stock de 100μg/100μl de la PLA₂ de

Bothrops andianus a partir de la cual se preparó soluciones de 1,5, 10 y 20μg/100μl de concentración de la PLA₂ miotóxica, estas dosis fueron diluidos en 100μl de PBS, enseguida se inyecto los 200 μl de la mezcla final, a nivel intramuscular y intravenoso a grupos de cuatro ratones.

A las 0, 2, 4, 6, 12 y 24 horas después del tratamiento  a cada ratón se le extrajo sangre del extremo caudal que fue colectado en capilares heparinizados, el plasma fue separado por centrifugación por 5 min a 10,000 rpm, para posteriormente determinar los niveles de creatina kinasa (CK), utilizando el kit CK-NAC (Creatine Kinase Diagnostick Germany), adicionando a 1 ml de sustrato 15 μl de plasma posteriormente se incubaron por 2 min a 37 ºC y se leyó a 340 nm.

La aplicación de la PLA₂ se realizó a nivel intravenoso e intramuscular a fin de establecer el mecanismo mionecrotico local y sistémico. (Ponce-Soto, et al., 2007).

Determinación de la actividad inflamatoria (Edema de pata)

La determinación de la actividad inflamatoria ocasionado por La PLA₂ de Bothrops andianus fue realizado siguiendo la metodología descrita por Levy (1969), en grupos de 4 ratones (18-20g).

Se realizó utilizado una solución stock inicial de 400 mg/ml de PBS (20 g/50l).

Después se hicieron diluciones, tomándose 500 l de la primera y mezclándose con 500l de PBS (10g/50l) y finalmente se realizó la última dilución Luego se toma 500ul de esa preparación y se mezcla con otros 500 l de PBS (5 g/l) con el mismo procedimiento para alcanzar una concentración de 2,5 g/50l. El edema de pata fue inducido inyectando 50μl de las diferentes soluciones de PLA₂ dentro del tejido subplantar de la pata trasera derecha y la pata izquierda recibió 50μL de PBS, como control.

Después de la inoculación  da PLA₂miotoxica, fueron hechas lecturas en intervalos de tiempo de 0 minuto, 30 minutos, 1 hora, 3 horas, 6 horas y 24 horas.

El edema producido fue medido usando un micrometro con reloj analógico para medidas externas (tipo compasso ODI-20).

RESULTADOS Y DISCUSION

Electroforesis en SDS-PAGE de la PLA₂ nativa y modificada.

La figura 3 muestra los perfiles de masa molecular en SDS PAGE de la PLA₂ nativa (pista 2) y de las proteínas modificadas con AA, NPSC, NBSF e BPB, en los residuos Lys, Tyr, Trp e His (pistas 3, 4, 5 y 6, respectivamente).

Todas las muestras fueron reducidas con DTT, mostrando para cada muestra la presencia de una única banda electroforética con masa molecular relativa en torno de 15 kDa, en relación a los marcadores de masa molecular (pista 1).

Fig. Nro.2. Electroforesis en gel de poliacrilamida (12,5 %). SDS-PAGE, coloreado con Comassie blue. Pista 1: marcadores de masa molecular (Mm), Pista 2: PLA2-I nativa; Pista 3: PLA2 + AA, Pista 4: PLA2 + NPSC, Pista 5: PLA2 + NBSF, Pista 6: PLA2 + BPB. Todas las muestras fueron reducidas con DTT.

Actividad miotóxica local in vivo.

Los estudios realizados para determinar el efecto miotóxico local de las formas modificadas de la PLA2 in vivo fueron realizados en ratones, inoculando las proteínas por via intramuscular. Resultados previos, (datos no mostrados) mostraron que 20 µg de la PLA2 nativa incrementaron los niveles de CK plasmáticos drásticamente en las primeras 3 a 6 horas del tratamiento, alcanzando hasta los niveles de 1373.11  55.17 U/L de CK, para posteriormente volver a los niveles normales después de 9 horas. La figura 4 muestra el efecto miotóxico inducido por la PLA2 nativa y las formas modificadas. Comparando los niveles de CK 3 horas después de iniciado el tratamiento, la miotoxicidad local inducida por la PLA2 fue reducida en 85 % por tratamiento con anidro acético (acetilación de Lys), 80 % por alquilación con BPB, 72 % después de la modificación de Tyr (NBSF) y 20 % después modificación de Trp ( NPSC ).

Fue investigado también el efecto de inhibidores sobre la actividad miotóxica de la PLA2. Los resultados evidencian que la heparina inhibe el efecto miotóxico de la PLA2 en 47%, ya que el máximo nivel de CK liberado es de 725.94 ± 137.25 U/L a las 3 horas de exposición a la toxina en comparación a la PLA2 nativa. El EDTA tiene mayor efecto inhibitorio de la actividad miotóxica de la PLA2, reduciendo en 74% esta actividad 3 horas

NBSF, BPB y NPSC) e incubadas con Heparina (Hep) y EDTA. Muestra los niveles de creatino quinasa (CK), incrementados después de 3 horas de la administración intramuscular de las proteínas (20 g), (n=5). Comparación de los tratamientos en relación a la PLA2 nativa *(p<0.05).

(miotoxicidad local). B.Determinacion del efecto miotóxico local en las formas modificadas de la PLA2 in vivo en ratones.

Determinación de la actividad edematogénica.

Para el estudio del efecto de las modificaciones químicas de la PLA2 sobre la actividad inflamatoria, se verificó uno de los eventos que ocurre en este proceso, la formación de edema. Para eso la PLA2 y sus formas modificadas con NPSC, NBSF, AA y BPB, todas en la dosis de 1 µg fueron disueltas en 50 µl de PBS, y aplicadas sobre la región intraplantar de la pata derecha de los ratones (18 – 20 g). La pata izquierda recibió 50 µl de PBS como control. Las medidas fueron realizadas después de una 1 hora de aplicación de las toxinas.

El edema es expresado como el porcentaje de aumento en volumen de la pata derecha con relación a la pata izquierda. El efecto edematogénico inducido por la PLA2 fue marcadamente reducido después de alquilada la His con BPB y la acetilación de Lys con anhídrido acético (edema inhibido en 70 % y 55 %, respectivamente). Este efecto fue parcialmente reducido por la modificación de resíduos de Tyr por el NBSF (40 %). La modificación de los resíduos de Trp no mostro reducción significativo en el efecto edematogénico (6 %). Las comparaciones son realizadas una hora después del inicio del tratamiento.

Fue evaluado también el efecto de inhibidores sobre la actividad inflamatoria de la PLA2. Los resultados evidencian que la heparina inhibe el efecto edematogenico de la PLA2 en 32 %, después de una hora de exposición a la toxina, ya el EDTA tuvo un mayor efecto inhibitorio, disminuido en 43 % del efecto edematogenico inducido por la PLA2 nativa.

Fig. Nro.5. Actividad edematogénica de la PLA₂, de las formas modificadas con NPSC, NBSF, AA BPB y de la inhibición con Heparina (Hep) y EDTA en ratones (18-20 g). La medida fue realizada 1 hora después de la aplicación de las toxinas. Cada punto representa la media ± el desvio-padron de un grupo de 5 animales. Comparación de los tratamientos en relación a la PLA2 nativa *(p<0.05).

DISCUSIÓN

En el presente trabajo se ha empleado tres pasos cromatográficos, el primero de exclusión molecular en Sephadex G-75, el segundo, de intercambio iónico (catiónico) a través de una columna SP 5PW (Waters) acoplado a un sistema de HPLC y el tercero a través de una cromatografía de carácter hidrofóbico en fase reversa acoplado a un sistema de HPLC. Teniendo en cuenta los severos efectos locales del veneno de Bothrops andianus y considerando que estos dependen de diversos componentes del veneno que actúan sinérgicamente, nos propusimos aislar una miotóxina básica PLA₂ así como también caracterizarla bioquímica y  mionecroticamente.

Las fosfolipasas A₂ miotóxicas aisladas, son moléculas compactas extremadamente estables a variaciones de temperatura, pH, concentración salina alta y la presencia de solventes orgánicos; lo cual está relacionado con sus características estructurales. De manera que, las fosfolipasas A₂ miotóxicas no sufren violentos procesos de desnaturalización en las condiciones usuales de trabajo, durante los procesos de purificación y durante los ensayos biológicos (Gutiérrez y Ownby 2003).

Al pasar el veneno crudo de B. bilineata  por la columna de Sephadex G-75, se obtuvieron cinco picos de proteína denominados del I al V, el pico III reveló una actividad fosfolipásica A₂ (Fig.1), la fracción con actividad fosfolipásica A₂ denominada como pico III fue sometida a un nuevo proceso de repurificación de intercambio iónico (catiónico), en una columna de cromatografía SP 5PW (Waters) acoplado a un sistema de HPLC (Fig. 2) en donde se obtuvo tres picos proteicos, denominados como: III-1, III-2 y III-3.

La actividad fosfolipásica A₂ se observó en el pico III-2, Seguidamente esta fracción III-2 proveniente del segundo proceso cromatográfico, fue sometida a un nuevo proceso de repurificación en un sistema de HPLC de fase reversa ó de hidrofobicidad donde se obtuvo la presencia de dos picos denominados como: III-2_A y III-2_B, de los cuales el pico III2_A fue el responsable de presentar una actividad fosfolipásica A₂ e inducir una acción miotóxica local. La electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato de sodio

(SDS-PAGE), revela el alto de grado de pureza de la fracción III-

2_A, con actividad fosfolipásica A₂, y capaz de inducir un efecto miotóxico local, pues aparece como una sola banda de proteína, lo cual confirma la idoneidad del método de purificación.

El peso molecular estimado de la fracción III-2_A, con actividad fosfolipásica A₂, y capaz de inducir un efecto miotóxico local es de 13 kDa (Fig. 4). Lo que concordaría con lo reportado con Gutiérrez y Ownby 2003, Kini, 2003 que establecen que las miotóxinas purificadas han sido caracterizadas como proteínas básicas de masa molecular entorno de 13 a 15 KDa. Se determinó   la masa molecular relativa de la fracción III-2_A calculada a través del programa Origin 5.0, muestra que la fracción posee una masa molecular alrededor de 13 KDa similar a la obtenida en la muestra.

En nuestros resultados de caracterización bioquímica relacionada al análisis de composición de aminoácidos, las fracción III-2_A con actividad fosfolipásica A₂ y efecto miotóxico, purificada a partir del veneno total de Bothriopsis bilineata, se encontró que la miotóxina contiene un mayor porcentaje de aminoácidos básicos (15% de Lys  y 11% de Arg) con respecto al porcentaje de aminoácidos ácidos (4% de Asp y 4 % de Glu) (Tabla 1). Es decir, la miotoxina posee 36% de Lys+ Arg, lo que en comparación al 8% de Asp+Glu, confirma su naturaleza básica y un acentuado carácter hidrofóbico  (Ala 3%,Ile 2 %,Leu 9 %, Trp %6, Val 5%) lo cual estaría relacionado con su alta estabilidad y que confirmaría que se trata de una fosfolipasa A₂ ya que  estas  miotóxicas se encuentran formadas de 110 a 135 residuos de aminoácidos, y presentan una naturaleza básica que es una característica común de todas las miotoxinas botrópicas aisladas(Ward y Arny 1996). Así por ejemplo podemos mencionar las miotóxinas aisladas de los venenos de B. asper, B. nummifer y B. moojeni, (Gutierrez et al., 1984; Gutierrez et al., 1986; Lomonte et al., 1989; Soares et al., 2000). De otro lado el registro de 121 aminoácidos para la fracción III2_A  y la presencia de 14 cisteínas nos sugiere la posible formación de siete puentes disulfuro que confirman que se trataría de una fosfolipasa A₂ correspondientes a la clase II en la clasificación establecida por Dennis, (1994).

El punto isoeléctrico (pI) de la fracción III-2_A se estimó con el programa DNASTAR y  fue de 9.55 lo que corroboraría la naturaleza básica de la miotóxina purificada.

Los estudios de los efectos miotóxicos “in vivo” son importantes para el diagnóstico del daño muscular. Los resultados indican  que la miotóxina produce una liberación máxima de Creatin Kinasa (CK) 4 horas después de la administración, lo cual representa un tiempo similar al encontrado con la miotóxina I de Bothrops asper y miotóxina II de Bothorps moojeni, las cuales provocan liberación máxima de Creatin-Kinasa a las tres horas (Gutiérrez, et al., 1991), y presenta un tiempo menor al de

Bothrops atrox que presenta una liberación máxima de CreatinKinasa a las seis horas después de la inoculación. Sin embargo, los niveles de cratin kinasa prácticamente se normalizan 24 horas después de la administración intramuscular. Cuando el veneno es administrado a nivel intravenoso no se observan marcadas variaciones de los niveles CK plasmáticos, por lo que la fracción III-2_A con actividad fosfolipásica A₂ y exhibe un efecto miotóxico local.

Los cortes histológicos del musculo gastrocnemius de ratónes  tratados con la miotóxina evidencia una severa necrosis del tejido, observándose no sólo una desorganización de las fibras musculares, sino además la desaparición de los núcleos  periféricos. Así mismo la miotóxina fue capaz de provocar rápidamente la fuga de creatin kinasa lo cual indicaría que la proteína actúa probablemente a nivel del sarcolema provocando desorganización.

Las miotóxinas o toxinas mionecróticas constituyen un grupo de proteínas del veneno con acción  específica en el músculo esquelético, afectando las fibras musculares, sin causar lesión importante en otros tejidos como conjuntivo, nervios y vasos (Lira Leite et al., (1993). Los diferentes estudios realizados con otras miotóxinas de venenos de serpientes también sugieren  que la acción primaria de estas proteínas sería a nivel del sarcolema. Sin embargo el lugar de unión a la membrana muscular, no es todavía conocido, aunque se supone que deben estar involucrados componentes que permitirían la unión específica al sarcolema (Huatuco, et al, 2004).

Finalmente, los resultados obtenidos en la presente investigación son estimulantes por el alto grado de pureza observado en las purificaciones y caracterizaciones bioquímicas que justifican un estudio más detallado de su actividad biológica y de su aplicación en el campo de la farmacología y otras ramas de la biología. 

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