Haruna L. Barazorda Ccahuana¹, María Isabel Herrera Valdivia¹, Diego Ernesto Valencia¹, Badhin Gómez Valdez¹

1. Centro de Investigación en Ingeniería Molecular del Vicerrectorado de Investigación de la Universidad Católica de Santa María

RESUMEN: Algunas profilinas vegetales son consideradas potentes alérgenos en pacientes sensibilizados al polen y/o alimentos, por su alta homología presentan reactividad cruzada como resultado de la alta identidad en la secuencia de aminoácidos. En la actualidad, se viene investigando la búsqueda de inhibidores de estas proteínas. El objetivo fue analizar el acoplamiento molecular entre polifenoles y profilinas de origen vegetal reportadas como alérgenos. Se han empleado métodos de la biología computacional: análisis filogenético mediante inferencia Bayesiana, modelamiento estructural por modelado por homología, y acoplamiento molecular. Los resultados muestran que existe una relación filogenética de ancestro común, por lo que es probable relacionar el análisis evolutivo con la reactividad cruzada entre especies con alta homología. Los valores del z-score y del ploteo de Ramachandran validaron la calidad de las estructuras terciarias modeladas; quedando aptas para el acoplamiento molecular. Se encontraron 14 polifenoles que se ubicaron en el mismo sitio de acción, las menores energías de acoplamiento se obtuvieron con las profilinas Zea m 12 (Zea mays) y Ara h 5 (Arachys hypogaea). Los hallazgos obtenidos en esta investigación nos dan una idea de lo que podría ocurrir en la nanoescala. Los polifenoles pueden llegar a ser una alternativa como aditivos al procesamiento de alimentos de origen vegetal para controlar reacciones alérgicas en nuestro organismo.

PALABRAS CLAVE: Profilinas, polifenoles, biología computacional

ABSTRACT: Some plant profilins are considered as potent allergens in patients sensitized to pollen and/or food, because of their high homology they show cross reactivity as a result of their high identity in their amino acid sequence. At present, the search for inhibitors of these proteins is being investigated. The objective was to analyze the molecular interaction between polyphenols and plant profilins reported as allergens. We use computational biology methods: Bayesian inference of phylogeny, structural modeling, and molecular docking. The results show that there is a common ancestor phylogenetic relationship, so it is likely to relate the evolutionary analysis with cross reactivity between species with high homology. Z-score and Ramachandran plot values validated the quality of the modeled tertiary structures, they were ready for the molecular interaction. We found 14 polyphenols that were located in the same site of action, the minor ones were related to the profilins Zea m 12 (Zea mays) and Ara h 5 (Arachys hypogaea). The findings in this research give us an idea of ​​what could happen at the nanoscale level. Polyphenols can become an alternative as additives in food processing to control allergic reactions.

KEYWORDS: Profilin, polyphenol, computational biology

INTRODUCCIÓN

Las enfermedades alergénicas se vienen incrementando en todas las regiones del mundo, una de las más considerables es la alergia alimentaria mediada por Inmunoglobulina E (1, 2). Una de las proteínas involucradas en el proceso alérgico debido al consumo frutas y vegetales son las profilinas, proteínas de 12 a 16 kDa presentes en todas las células eucariotas; cuya función es polimerizar la actina a nivel celular. En 1991, Valenta y colaboradores identificaron a la primera profilina alergénica (Bet v 2), encontrada en el polen de abedul (3); posteriormente, consideraron a este grupo de proteínas funcionales como panalergenos, dando explicación a la presencia de reacciones cruzadas en pacientes con alergia a pólenes y frutas de plantas de diferentes familias (4). Según la Organización Mundial de la Salud y la International Union of Immunological Studios (Unión Internacional de Estudios Inmunológicos) - WHO/IUIS se han reconocido 48 profilinas como alérgenos, de los cuales 25 son de origen alimentario (http://www.allergen.org). Las tasas de sensibilización en la población son variadas según la zona geográfica, fluctuando entre 16% a 50% en pacientes con Síndrome de Alergia Oral (SAO) (5). La indicación a los pacientes para evitar estos problemas consiste en educación alimentaria para evitar el consumo del alérgeno que puede estar en alguna fruta o alimento procesado (2); también se practican terapias inmunomoduladoras en los pacientes con alergias específicas (2, 6, 7).

El procesamiento de alimentos ha involucrado diferentes técnicas para disminuir el potencial alérgico, el cual puede incluir etapas de: almacenamiento, preparación, separación, aislamiento o purificación. Se ha demostrado que algunos procesos pueden influenciar, pero no eliminar por completo el potencial alergénico de las proteínas, específicamente algunos disminuyen la interacción de la proteína alérgena con la inmunoglobulina E (8). Los polifenoles son moléculas que forman parte de los metabolitos secundarios de una gran diversidad de plantas en todo el mundo (9). El interés de la investigación en estas moléculas ha crecido considerablemente durante las últimas décadas; debido fundamentalmente al descubrimiento de sus propiedades antioxidantes y anticancerígenas (10), su nivel de acción se da modulando enzimas y receptores proteicos (11). Al unirse a las proteínas pueden formar complejos insolubles, modificando funciones en las proteínas; esta cualidad puede emplearse para el desarrollo de moduladores o inhibidores de proteínas.

Esta investigación tuvo como objetivo evaluar la relación evolutiva entre 10 especies de profilinas vegetales con el fin de entender si existe alguna relación con el análisis filogenético y la reactividad cruzada, así mismo analizar la relación estructural entre estas y la predicción de posibles lugares de unión con 25 polifenoles como posibles inhibidores, mediante métodos de biología computacional.

METODOLOGÍA

Obtención de nucleotídicas de las proteínas

Se seleccionaron arbitrariamente 10 especies de plantas (alérgenos alimentarios y no alimentarios) con capacidad alergénica verificada (http://www.allergen.org/). De los cuales se obtuvo sus secuencias nucleotídicas de la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) basados en el GenBank Nucleotide (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/); correspondientes a: Apium graveolens (apio, ID: AF129423), Betula pendula (abedul, ID: M65179), Chenopodium album (fresno, ID: AY082337), Cynodon dactylon (césped, ID: Y08390), Zea mays (maíz, ID: AF201459), Arachys hypogaea (maní, ID: AF059616), Citrus sinensis (naranja, ID: AJ865015), Musa acuminata (plátano, ID: AF377948), Glycine max (soya, ID: AJ223982) y Solanum lycopersicum (tomate, ID: AJ417553).

Análisis filogenético

Las 10 secuencias nucleotídicas fueron introducidas para el análisis de Indice de saturación en DAMBE (Data Analysis in Molecular Biology and Evolution) (12), utilizando el test introducido por Xia para medir el Índice de saturación de Sustitución (Iss), con la finalidad de valuar si las secuencias son útiles para análisis filogenético. El alineamiento múltiple de las secuencias se realizó mediante el método iterativo MUSCLE (Multiple sequence alignment by log expectation) (13), integrado en el software de Mesquite v3.04 (14). Con el programa Gblocks (15) se eliminaron posiciones de homología dudosa donde existían regiones muy variables o con un gran número de brechas (gaps), además se eliminaron sitios mal alineados y regiones divergentes.

Para la reconstrucción filogenética se utilizó el análisis de inferencia Bayesiana con el programa MrBayes v3.1 (16, 17). Las probabilidades posteriores de cada rama del árbol se aproximaron utilizando el método de Cadenas de Markov y Monte Carlo (MCMC) con el algoritmo Metropolis Hastings (18), para condicionar la lectura contando la frecuencia de árboles que presentan la misma correspondencia de taxones durante el curso del análisis. El modelo utilizado en el análisis filogenético fue el modelo general de tiempo reversible con una proporción de sitios invariables y una distribución de forma gama (GTR + I + γ ). El cálculo del análisis se hizo a 100 millones de generaciones mediante dos cálculos independientes, se usó un burn in relativo de 25% para el diagnóstico. La visualización del árbol se hizo en el programa FigTree v1.4.0 (19).

Modelamiento por Homología

La estructura terciaria fue obtenida por modelamiento por homología en el servidor Swiss-Model (https://swissmodel.expasy.org/). Los códigos de acceso de las secuencias aminoacídicas fueron: AAD29409 (Apium graveolens), AAA16522 (Betula pendula), AAL92870 (Chenopodium album), CAA69670 (Cynodon dactylon), AAG35601 (Zea mays), AAD55587 (Arachys hypogaea), CAI23765 (Citrus sinensis), AAK54834 (Musa acuminata), CAA11756 (Glycine max), CAD10377 (Solanum lycopersicum). Las estructuras obtenidas se validaron utilizando el servidor ProSA mediante el valor del Z-score, el que nos mide la calidad general del modelo (20). Además, se empleó el ploteo de Ramachandran para validar los modelos estructurales usando el servidor RAMPAGE (http://mordred.bioc.cam.ac.uk/~rapper/rampage.php).

Evaluación del pocket (bolsillo)

Para la detección del bolsillo o pocket se utilizó el servidor PockDrug (http://pockdrug.rpbs.univ-paris-diderot.fr) (21), prediciéndose los dominios más drugables y el volumen de la cavidad del bolsillo. Posteriormente, la generación de conglomerados y residuos interactuantes se realizó en base al uso de la cuadrícula (grilla) obtenida por medio de la búsqueda del sitio de unión y porcentaje de drugabilidad.

Obtención y análisis de los ligandos

Los ligandos fueron compuestos fitoquímicos seleccionados en base a la revisión publicada por Manach y col. (22), quienes evaluaron a polifenoles distribuidos en alimentos. Se hizo la búsqueda de las estructuras de los 25 polifenoles seleccionados en la base de datos PubChem (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/search.cgi).

Se analizó la Absorción, Distribución, Metabolismo, Excreción y Toxicidad (ADMET) de todos los compuestos seleccionados. Este análisis se ha convertido en uno de los temas más importantes para evaluar la disposición de un compuesto en el organismo. Se utilizó el servidor SwissADME (http://www.swissadme.ch/index.php) (23).

Acoplamiento Molecular

Se realizó el acoplamiento y el cribado virtual (virtual screening) usando el programa iGEMDOCK (24) (http://gemdock.life.nctu.edu.tw/dock/igemdock.php); haciendo interactuar a los 25 polifenoles con las 10 profilinas vegetales a 300 iteraciones, 80 generaciones y 10 soluciones. Esta aproximación analiza la orientación de compuestos frente a los receptores utilizando patrones para generar un conjunto enfocado.

Se utilizó Chimera UCSF como visualizador Chimera UCSF (25).

RESULTADOS

Análisis filogenético

El análisis de saturación de sustitución de los alineamientos nucleotídicos mostró valores de   Iss= 0.3026 y Iss crítico= 0.7176 asumiendo una topología simétrica, y 0.5770 para una topología asimétrica; esto nos indica que las secuencias han experimentado una pequeña saturación de sustitución; por lo tanto, pueden ser usadas en reconstrucción filogenética. Las diez secuencias de profilinas alineadas en Gblock nos permitieron obtener 388 posiciones conservadas de 1063 originales, equivalente al 36%. En base a este proceso de conservación se realizó el alineamiento de las secuencias con el método MUSCLE. El análisis filogenético estableció la frecuencia y tasa de cambio entre los nucleótidos que conforman la secuencia dentro del alineamiento. El proceso de muestreo con MCMC fue usado para estimar la genealogía ancestral, mostrándose una distancia de 0.3 cambios esperados por sitio (Figura 1). Adicionalmente, nos presenta bajos valores de boostrap para la mayoría de nodos, donde la topología de los árboles presentaron diferentes tasas de cambio de cada subunidad dentro de las especies relacionado con la longitud de las ramas.

Fig. 1. Árbol filogenético de las profilinas evaluadas. 

Análisis de Estructuras

El análisis ADMET (Tabla 1) nos brinda las siguientes propiedades: LogP (coeficiente de partición octanol-agua), área de superficie polar topológica (TPSA), solubilidad, absorción gastrointestinal, capacidad inhibitoria de los citocromos CYP1A2, CYP2C19, CYP3A4 y cumplimiento de la Regla de Lipinski. Todos los compuestos presentaron un LogP menor a 2.24. Los valores del TPSA fluctuaron entre 57.53 (ácido 4-hidroxibenzóico) y 164.75 (ácido clorogénico). Cuatro compuestos tuvieron solubilidad moderada: apigenina, daidzeína, genisteína y gliciteína; el resto presentó optima solubilidad. La absorción intestinal fue alta en todos los compuestos a excepción del ácido clorogénico y la miricetina, quienes presentaron absorción baja.

Tabla 1. Características y análisis ADMET de los 25 polifenoles y análisis ADMET.

*TPSA: área de superficie polar topológica

Las 10 profilinas analizadas tuvieron alta identidad (80% - 100%) respecto al molde utilizado por el servidor, la cobertura presenta estuvo entre 98% - 100%. En la tabla 2 se describen las características del modelamiento por homología. Las plantillas utilizadas tuvieron una resolución entre 1.7 – 2.2 Å, obtenidas por difracción de rayos x; además, los modelos presentaron alta calidad de cadena, lo que ayuda en la generación de modelos estructurales.

Tabla 2. Características del Modelado por homología.

*Porcentaje de identidad con la estructura molde,

⁺Resolución de la plantilla obtenida por rayos X

En la Figura 2 se muestra la estructura tridimensional de las profilinas. Se observan las características de su estructura secundaria, como láminas beta (color azul) en número de 6 a 7; esta forma secundaria nos indica la alta estabilidad estructural que poseen las profilinas. Esta característica puede permitir a las profilinas resistencia a altas temperaturas y a pH bajos, como el que tiene el jugo gástrico. Por otro lado, la estructura de las profilinas es similar en las diferentes especies, a pesar de que no comparten un ancestro común entre ellas.